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近日，深圳大学王宇课题组，联合广州实验室赵金存教授，清华大学谭旭研究员，中国科学院动物研究所周兵研究员以及深圳疾控中心张仁利教授，在Advanced Science上发表了题目为Repurposing CRISPR/Cas to Discover SARS-CoV-2 Detecting and Neutralizing Aptamers的文章，报道了一种新颖的基于CRISPR/Cas的RNA配体筛选系统：CRISmers（CRISPR based aptamers screening system）。有别于传统的SELEX筛选，CRISmers将RNA适配体筛选从溶液体系或者细胞表面搬到了细胞内，从而提供了胞内天然生物环境下的RNA和蛋白质的折叠与相互作用，并避免了筛选过程中的环境波动影响。

首先，该团队设想了CRISmers的概念，然后应用GFP和此前经SELEX筛选获得的RNA适配体进行了初步的概念验证和筛选系统的关键参数指征，从而得到了CRISmers筛选系统的工作流程。简单来说，将适配体随机序列文库以pooled方式构入进sgRNA骨架，若文库中含有与特定靶蛋白结合的亲和序列，即可招募与靶蛋白融合的转录激活因子，从而激活下游抗性基因的表达。通过施加抗性筛选压力，即可将携带亲和配体的细胞在体系中富集。包含RNA适配体的文库通过慢病毒递送，整合进入细胞基因组。RNA适配体的序列信息可以通过提取基因组、定向扩增配体区段、以及深度测序获取。

CRISmers理论上具有广泛的靶向性，但考虑到研究进行期间正值新冠疫情，该团队将第一个靶标指向了SARS-CoV-2刺突蛋白受体结构域RBD。通过初级筛选和二级验证，获得了可特异靶向RBD的2个优选的RNA适配体，且在体外呈现出有效的病毒检测和中和活性。有趣的是，和其他论文中报道的一致，核酸配体表现出不受病毒突变影响的现象，具有广谱抗SARS-CoV-2的潜力。这一现象也许和核酸配体内在的柔性结构特性有关。类似的，不同的CRISPR/Cas系统的向导RNA也观察到可以互换的现象。进一步，选取其中一条RNA适配体，团队发现，结合多种修饰和偶联，包括2’-氟嘧啶和2’-甲氧基RNA修饰（提升RNA稳定性），以及5’端胆固醇（呈递到呼吸道上皮细胞表面）和分子量为40kDa的聚乙二醇（延长体内半衰期）的偶联，经滴鼻给药，在小鼠体内实现了对Omicron BA.2活病毒的预防型和治疗型抗病毒中和活性。通过对比实验，团队发现胆固醇和聚乙二醇的偶联对于动物体内的活性不可或缺，尽管它们对于细胞水平上的中和活性可有可无。

最后，该团队还对CRISmers系统的通用适配性进行了验证。应用靶向SARS-CoV-2 RBD筛选获得的两个RNA配体，对CRISmers系统中的元件分别进行了替换，包括（1）将dSpCas9替换成更小体积版本的dCasMINI-V4（2）将抗性基因替换成荧光蛋白；（3）将筛选宿主细胞由人HEK293T细胞系替换成大肠杆菌，均可捕获到RNA配体与RBD的亲和力信号。

近年来核酸药物的成功主要来自于以“信息分子”发挥作用的方式，包括siRNA, ASO, mRNA。与之对应的是，RNA作为“结构分子”虽然对于生物学的很多方面也非常重要（某种意义上，CRISPR/Cas中的向导RNA就是一个大aptamer！），但是以这样的角色转化为药物，虽然潜力巨大，但尚待发掘。CRISmers作为研究RNA作为“结构分子”的工具技术将可能发挥一定的作用。另外，CRISmers尽管看起来也适用于膜外的靶标，理论上而言对于膜内的靶标具有更加独特的价值。siRNA和mRNA等核酸药物跨过细胞膜对于实现它们的临床应用具有重要意义。随着核酸递送技术的进步，胞内靶点对于核酸药物而言也许将逐步获得和小分子化学药一样的可及性。因此，鉴于该论文的工作仅仅是CRISmers的第一个靶点，且位于病毒表面，该筛选系统尚待更多靶标和更长时间的检验。当下，基于上述成果，团队正在推进抗新冠病毒的候选鼻喷药物面向临床应用的开发工作。最新的测试显示，论文中报道的优选RNA适配体对于XBB.1.5和XBB.1.16假病毒保持活性。与此同时，面向后疫情时代，CRISmers正在被用于靶向癌症等疾病的研究。

中国科学院动物研究所博士生张菊和广州国家实验室博士后朱爱如为该论文的共同第一作者，王宇教授、赵金存教授、谭旭研究员、周兵研究员、张仁利教授为该论文共同通讯作者。

附：深圳大学王宇教授课题组副研究员/博士后招聘启事

王宇，深圳大学特聘教授，博士生导师。中国科学技术大学本科，哈佛大学博士。入选中科院、广东省、深圳市高层次人才计划。深圳市科技创新委员会科技重大专项和科技抗疫专项咨询专家组成员。迄今主持和参与了科技部国家重大科学研究计划课题、国家自然科学基金委重大培育项目等9项国家和省部级项目以及多项深圳市重大项目。以通讯作者为 Elife、Cell Chemical Biology等国际重要学术期刊撰写研究论文点评和领域综述。担任Advanced Science、 Nucleic Acids Research、Theranostics、Protein & Cell等国际重要学术期刊审稿人。迄今在国际学术期刊上发表了25篇学术论文。研究工作被AAAS EurekaAlert！等知名科学媒体、Nature Medicine、Cell Stem Cell等高水平学术杂志等关注和肯定。其中以通讯作者或者第一作者在Advanced Science、Nucleic Acids Research、 Cancer Research、PNAS、Molecular Therapy-Nucleic Acids、Cell Chemical Biology （2篇）、eLife、Life Medicine、Current Opinion in Cell Biology、ACS Chemical Biology （2篇）等国际重要学术期刊发表论文。持有多项涉及候选药物分子结构、化学药物诱导CRISPR系统、药物筛选技术、药物靶蛋白标记等的发明专利。其中，一项关于药物筛选技术的专利授权罗氏-基因泰克（Roche-Genentech），一个候选药物进入临床试验。王宇课题组主要从事小分子化学/核酸药物与CRISPR/Cas技术的交叉研究，欢迎已经毕业/即将毕业的博士生加入，一起面向重要科学问题和技术需求，开展新颖有趣的科研和转化。课题组将提供良好的科研条件和具有竞争力的薪资待遇 (副研究员/博士后，年薪40-50万)。本招聘长期有效。

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